生物膜降解酶对304不锈钢上副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

以副溶血弧菌生物膜基质为靶点,采用96孔板结晶紫染色法筛选出纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶k为单酶,将单酶组合为复合酶,在单因素实验的基础上,采用响应面分析法优化组合酶浓度。通过结晶紫染色、菌落计数、扫描电镜等,评价组合酶对304不锈钢上副溶血弧菌生物膜的抑制作用。响应面优化得到的组合酶中纤维素酶浓度为1.00 mg/mL,脂肪酶浓度为1.10 mg/mL,蛋白酶k浓度为1.50μg/mL时生物膜抑制率最大,为89.73%,比优化之前的各单酶相比,对副溶血弧菌生物膜的抑制率有显著性提高,与预测基本相符,说明模型拟合良好,组合酶中各单酶浓度准确可行。优化得到的组合酶有效抑制了304不锈钢上副溶血弧菌生物膜的生长,抑制率为59.35%,扫描电镜图也证实了复合酶的抑制效果。生物膜降解酶复合有效提升了对生物膜的抑制率,为致病菌生物膜的降解及消除提供了新的思路。

副溶血弧菌属于嗜盐性的革兰阴性菌,可以从海产品如鱼、对虾、蟹、贝类和海藻中分离得到,是引起食源性疾病的主要致病菌之一。副溶血弧菌污染食品后,,极易引起急性肠胃炎,使人发生恶心、呕吐、腹泻等症状,严重者可以引起昏迷、脱水甚至死亡。细菌生物膜是细菌黏附在非生物或生物表面,并被自身分泌的胞外多聚物如蛋白质、糖类、脂类、胞外DNA等包裹形成的一种高度组织化、系统化的微生物膜状结构,是细菌在恶劣环境中为适应生存环境而形成的一种与浮游状态相对应的存在形式。生物膜内有细胞外基质包裹的多层细菌生长,可避免被宿主防御系统清除,并阻碍大部分抗菌药物进入细菌内。与浮游细胞相比,形成生物膜的细菌对抗菌药物的抵抗能力会提高,形成生物膜的细菌具有高度耐药性和能逃避免疫系统攻击的特点,使其感染易慢性化并难于控制。因此,开发有效的控制和去除细菌生物膜的方法是必要的。

由于生物膜降解酶能分解细胞外基质,促进生物膜分离,因此被认为是一种新型的、环保的生物膜控制方法。由于细菌生物膜基质的多样性,不同生物膜降解酶对细菌的作用不尽相同。研究表明,纤维素酶对玻璃表面铜绿假单胞菌生物膜的形成有部分抑制作用。α-淀粉酶可以有效的清除芽孢杆菌的生物膜,并抑制生物膜的形成。

生物膜降解酶是去除细菌生物膜的有效途径,目前关于不同生物膜降解酶的协同增效作用缺乏了解。因此,本研究旨在探讨脂肪酶、纤维素和蛋白酶K的复合优化,并对其在304食品级不锈钢上副溶血性弧菌生物膜的抑制作用进行初步研究。研究结果有助于控制副溶血性弧菌生物膜的形成,进一步为生物膜降解酶的应用提供依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株

副溶血弧菌VIB461由中国海洋大学应用海洋微生物实验室提供。

1.1.2培养基及酶

2216E琼脂、TSB3%NaCl)肉汤、TSA3%NaCl)琼脂购自索莱宝生物科技有限公司;纤维素酶(3 U/mg)、脂肪酶(20 U/mg)、蛋白酶k30 U/mg)购自索莱宝生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器及试剂

PBS缓冲液、结晶紫、醋酸钠缓冲液、96孔板、全自动高压灭菌锅,致微仪器有限公司;超净工作台,苏州苏洁净化设备有限公司;振荡培养箱,国华电器有限公司;酶标仪,美国Bio-Tek公司;扫描电镜,德国ZEISS公司;实验所用试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1菌悬液的制备

-80冰箱中取出保存的副溶血弧菌VIB461菌株在2216E琼脂平板上活化,挑取单菌落至含3%NaCl TSB,过夜活化后,按1%的比例接种于新鲜的含3%NaCl TSB中,30180 rpm/min振荡培养过夜至菌液浓度为108 CFU/mL

1.2.2复合生物酶生物膜降解酶对副溶血弧菌生物膜的抑制

将制备好的菌悬液按1%的接种量与酶以1:3的比例加入到96孔板中,同时设酶的对照组。将96孔板放置于30180 r/min振荡培养24 h

1.2.3副溶血弧菌生物膜的测定

采用结晶紫染色方法,取出孔板,弃去游离菌,用300μL无菌生理盐水清洗3次,然后60干燥固定15 min,再每孔加入0.1%的结晶紫溶液300μL,染色15 min,用300μL无菌生理盐水清洗3次,干燥后加入95%的无水乙醇300μL,放置10 min,在595 nm波长处测OD值,抑制率计算参考下式:

1.2.4单因素实验

纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶k浓度对副溶血弧菌生物膜形成的影响,采用二倍稀释法将单酶进行稀释,按1.2.2的方法加入到菌液中培养,设定相应的对照组,采用结晶紫染色法测定生物膜的抑制率。

1.2.5响应面优化实验设计

在单因素优化试验的基础上以最优纤维素酶浓度(A)、脂肪酶浓度(B)、蛋白酶k浓度(C)、自变量,根据Box-Behnken设计原理[16],进行响应面分析试验。以生物膜抑制率为响应值,优化三种酶的浓度并组成最佳酶组合。因素水平设计见表1

1.2.6 304不锈钢上生物膜的菌落计数

菌落计数:将304不锈钢片切割为长2 cm1 cm的长方形,灭菌后加入到菌液中,按1.2.2方法培养24 h后小心取出,将PBS清洗后的不锈钢片放入5 mL的生理盐水中,在20%功率的超声波振荡器中振荡10 min,计算不锈钢上生物膜活菌数。

1.2.7 304不锈钢上生物膜的结晶紫染色

在含有TSB培养基和不锈钢片试管中,将制备好的108 CFU/mL的菌悬液按1%的接种量与酶以1:3的比例加入,180 r/min培养24 h,取出不锈钢片。用1.2.3的方法测定生物膜形成。

1.2.8扫描电镜观察304不锈钢上的生物膜

在含有TSB培养基和不锈钢片试管中,将制备好的108 CFU/mL的菌悬液按1%的接种量与酶以1:3的比例加入,180 r/min培养24 h,取出不锈钢片,用PBS冲洗两遍,加入2.5%戊二醛固定液在4条件下固定12 h,经过漂洗、乙醇逐级梯度脱水、干燥、装样后,在扫描电镜下观察。

1.2.9数据分析

试验数据均用平均值±标准差表示,用SPSS软件对数据进行单因素方差分析,进行多重比较,p<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1不同浓度纤维素酶对副溶血弧菌生物膜的抑制作用

运用不同浓度的纤维素酶研究纤维素酶浓度对副溶血弧菌生物膜的抑制作用,如图1所示,随着纤维素酶浓度的增加,副溶血弧菌生物膜的抑制率逐渐上升,当纤维素酶浓度为1.50 mg/mL时,生物膜抑制率达到做高为81.94%,之后趋于平缓,说明在纤维素酶浓度较低时生物膜的抑制率对纤维素酶浓度依赖性增加,但纤维素酶浓度到达1.50 mg/mL之后,抑制率没有发生显著性变化。Nguyen等研究发现,与低浓度相比,递增浓度的DNase I不会更多抑制单增李斯特菌生物膜的形成[17],本研究中,与低于1.50 mg/mL相比,递增浓度的纤维素酶不会抑制更多的副溶血弧菌生物膜的形成,与之前的研究结果相符,因此选择纤维素酶浓度的最佳点为1.50 mg/mL

2.1.2不同浓度脂肪酶对副溶血弧菌生物膜的抑制作用

采用纤维素酶同样的方法对脂肪酶浓度进行优化,结果如图2所示。随着脂肪酶浓度的增加,生物膜的抑制率呈先上升后下降的趋势,Lefebvre等人研究发现,α-淀粉酶反而增加了荧光假单胞菌的代谢活性,并且表明所选择的酶在生物膜控制中的作用是适度的,因此,我们猜测,脂肪酶在培养生物膜后期会出现抑制率降低的情况,需进一步研究[18]。在脂肪酶浓度为1.50 mg/mL时,副溶血弧菌生物膜抑制率达到最高值60.21%,因此选择脂肪酶浓度为1.50 mg/mL

2.1.3不同浓度蛋白酶k对副溶血弧菌生物膜的抑制作用

蛋白质酶k对副溶血弧菌生物膜的抑制作用如图3所示,随着蛋白酶浓度的增加,副溶血弧菌生物膜的抑制率逐渐上升,当蛋白酶k浓度为2.00μg/mL时,生物膜抑制率达到做高为58.96%,之后趋于平缓,说明在浓度较脂肪酶浓度较低时生物膜的抑制率对蛋白酶k浓度依赖性增加,但纤维素酶浓度到达2.00μg/mL之后,抑制率没有发生显著性变化。Nguyen等人研究发现,蛋白酶k浓度到达一定数值后,其对李斯特菌生物膜的清除率不再增加[17]。与前人对蛋白酶k的研究相比,本研究中的蛋白酶k浓度也会在一定数值后其作用不再增加,但由于作用的细菌不同,蛋白酶k的最佳浓度也不同,因此,在本研究中选择蛋白酶k浓度的最佳点为1.50 mg/mL

2.2响应面实验结果

2.2.1响应面实验设计与结果及方差分析

采用Design-Expert软件,分别对纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶k三个对副溶血弧菌生物膜抑制效果进行Box-Benhnken试验设计,获得17个试验点,实验数据与结果如表2所示。确定生物膜抑制率对以上因素的二次多项回归模型为:

Y=89.11-0.53A-0.56B-0.099C+0.24AB-0.045AC+0.50BC-0.29A2-0.80B2-0.21C2由方差分析表3可知,实验选用的模型p<0.0001,表明该模型极显著;失拟项p=0.5568>0.05,表明失拟项不显著,与实际实验拟合度好;模型的校正系数RAdj=0.9498,表明该模型可以评价94.98%生物膜抑制率的变化。R=0.9780,表明实验误差小,该模型适合分析纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶k三种酶对VP生物膜抑制的影响。通过F检验结果可知,各种酶对生物膜影响的主次顺序为B>A>C,即脂肪酶对响应值的影响最大,其次是纤维素酶,最后是蛋白酶k。模型中一次项AB对响应值的影响均为极显著(p<0.01),模型中交互项ABBC对相应值的影响为显著(p<0.05),AC对相应值的影响为不显著(p>0.05)。

2.2.2响应面分析

通过纤维素酶与脂肪酶(AB)、纤维素酶与蛋白酶kAC)、脂肪酶与蛋白酶kBC)的响应面图可以看出(图4所示),脂肪酶与蛋白酶kBC)响应面弯曲程度最大,表明两者交互作用最明显,脂肪酶和蛋白酶k对生物膜的抑制作用可以相互促进;纤维素酶与脂肪酶(AB)响应面弯曲程度次之,表明两者交互作用次之;最后是纤维素酶与蛋白酶kAC),两者响应面较平坦,交互作用不明显。这与方差分析结果相吻合。

2.2.3最佳复合酶验证

利用Design-Expert软件进行响应参数的优化,通过响应曲面分析,确定获得生物膜抑制率最大值的条件为:纤维素酶浓度为1.00 mg/mL,脂肪酶浓度为1.10 mg/mL,蛋白酶k浓度为1.50 mg/mL,此时生物膜抑制率最大为89.73%,根据优化条件得到的抑制率为89.65%,与预测基本相符,无显著性差异。

在细菌细胞中,超过90%的生物膜基质以三维空间结构存在,因此,通过降解生物膜基质是去除生物膜的有效方法,酶作为一种绿色高效的生物膜抑制剂已被广泛应用于金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、李斯特氏菌。如采用β-葡聚糖酶处理可显著抑制荧光假单胞菌生物膜的形成[20],采用Benzonase处理可使金黄色葡萄球菌生物膜抑制率达79.80%。由于生物膜基质包含蛋白质、DNA和多糖等多种组分,单一酶降解生物膜有其局限性。蛋白酶k只降解蛋白质类物质、纤维素酶只降解多糖类物质、脂肪酶只降解脂类物质,本研究在前人研究的基础上采用生物膜降解酶复合,利用纤维素酶、蛋白酶k、脂肪酶的交互作用,打破单一酶降解的局限性,显著提升了副溶血弧菌生物膜的降解率,为副溶血弧菌的有效控制提供了理论基础。

2.3组合酶对304不锈钢上生物膜的抑制作用

2.3.1结晶紫染色与菌落计数

由于副溶血弧菌常常存留在某些食品接触面上,如聚苯乙烯、食品级不锈钢等,因此,复合酶优化的过程是以聚苯乙烯为载体,为了研究复合酶对副溶血弧菌生物膜在不同载体上的抑制效果,我们增加了以不锈钢为载体的研究,结果如图5所示,通过结晶紫染色和菌落计数可以看出,复合酶处理使304不锈钢上副溶血弧菌的生物膜上的细菌数量显著降低,使生物膜的厚度显著降低。

有研究表明,生物膜的形成与生物膜内的嵌入细菌之间存在显著的相关性,林镯等人发现金黄色葡萄球菌生物膜内的细菌数量随着Benzonase酶浓度的升高而降低,而其生物膜的厚度也随之降低[21]Melvin等人发现0.70 mm香芹酚可以减少2.0 lg(CFU/mL)的沙门氏菌在不锈钢表面的附着,因此得出香芹酚导致细菌附着减少从而形成较弱的生物膜[22]Harmsen等人发现蛋白酶K对玻璃片上李斯特菌附着的生物膜没有显著作用,而Nguyen等人发现蛋白酶k可以显著降低李斯特菌在不锈钢上的附着[17]。前人的研究表明了抑制细菌在不锈钢上的附着可以抑制细菌在不锈钢上生物膜的形成,在本实验中,复合酶同样可以减少2.3 lg(CFU/mL)的副溶血弧菌在不锈钢表面的附着,可以显著的抑制304不锈钢上副溶血弧菌的生物膜形成。但由于细菌种类不同,与前人研究结果相比,不同的酶作用效果也不一样,而复合酶除降解生物膜基质之外是否还通过其他作用抑制生物膜的形成,这还需进一步研究。

2.3.2扫描电镜观察

通过扫描电镜,我们可以清楚的看到细菌粘附在不锈钢上的状态及复合酶的抑制效果。如图6所示,对照组细菌可以大量黏附在不锈钢上,并形成局部的生物膜(6a),经过复合酶的处理后,只有个别细菌粘附在不锈钢板上,没有形成生物膜(6b)Cai等人通过扫描电镜可以清晰的发现,经过酸性电解水处理的荧光假单胞菌生物膜被分离,被分解成小的胞外基质聚集体,胞外基质和细菌黏附数量相比于未处理组显著减少,酸性电解水可以有效的抑制荧光假单胞菌生物膜的形成。Lekbach等人通过扫描电镜可以观察到经过丹参提取物处理的在不锈钢上的铜绿假单胞菌生物膜由原来的紧密网状结构变为稀松的小聚集体,并且菌体形态发生变化,内溶物外渗,由此发现丹参提取物可能通过作用于细菌的细胞膜从而抑制铜绿假单胞菌在不锈钢生物膜上的形成[25]Nguyen等人通过扫描电镜图发现,与对照组相比,200μg/mL蛋白酶k能完全去除李斯特菌在不锈钢上的生物膜,在本实验中,从图6可以看出含有蛋白酶k的复合酶虽然能有效降低不锈钢上副溶血弧菌的黏附及胞外聚集体的形成,但却不能完全清除生物膜,这可能是由于不同细菌生物膜胞外基质的种类不同,各类基质的含量也不同造成的,这说明,在副溶血弧菌生物膜基质中蛋白质的含量要比李斯特菌含量少,先前已有研究发现DNAI抑制和分散金黄色葡萄球菌生物膜,但对表皮葡萄球菌生物膜无效。因此,本实验优化得到的复合酶是可以有效降低副溶血弧菌在食品加工器皿上的附着滋生,进一步提升食品安全性。

3结论

本研究通过响应面优化确定纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶浓度复合其浓度分别为1.0 mg/mL1.1 mg/mL1.5 mg/mL,在该条件下,复合膜对副溶血弧菌生物膜抑制率可达89.73%,但载体不同,复合酶的抑制效果不同,其扫描电镜结果进一步证实了抑制效果,这为以生物膜基质为靶点的致病菌控制策略提供了理论依据。

文章作者:不锈钢管|304不锈钢无缝管|316L不锈钢厚壁管|不锈钢小管|大口径不锈钢管|不锈钢换热管

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